嵌合抗原受體T細(xì)胞療法作為一種革命性的過(guò)繼性細(xì)胞免疫治療策略，通過(guò)基因工程改造T細(xì)胞，使其能夠以MHC非限制性的方式識(shí)別并殺傷腫瘤細(xì)胞。CAR-T細(xì)胞的抗腫瘤活性并非依賴(lài)單一機(jī)制，而是通過(guò)一個(gè)復(fù)雜而精密的多軸協(xié)同網(wǎng)絡(luò)實(shí)現(xiàn)的。

-01-

非經(jīng)典免疫突觸的形成

與傳統(tǒng)T細(xì)胞受體（TCR）T細(xì)胞相比，CAR-T細(xì)胞與靶細(xì)胞形成的免疫突觸在結(jié)構(gòu)和動(dòng)力學(xué)上存在顯著差異，這些差異是其實(shí)現(xiàn)高效殺傷的基礎(chǔ)。

經(jīng)典的TCR免疫突觸是一個(gè)高度組織化的“牛眼”狀結(jié)構(gòu)，由中央超分子活化簇、外周超分子活化簇和遠(yuǎn)端超分子活化簇構(gòu)成，確保了信號(hào)傳導(dǎo)的精確性和細(xì)胞毒性顆粒的定向釋放。然而，CAR-T細(xì)胞形成的免疫突觸則呈現(xiàn)出一種更為無(wú)序和緊湊的模式。研究發(fā)現(xiàn)，CAR免疫突觸缺乏Lck在cSMAC中的聚集，并且其內(nèi)徑顯著小于TCR免疫突觸，這與CAR-T細(xì)胞更快的脫離速度相關(guān) 。此外，蛋白質(zhì)組學(xué)分析顯示，CAR-T細(xì)胞中近端信號(hào)蛋白PKCδ被迅速下調(diào)，提示CAR啟動(dòng)的信號(hào)持續(xù)時(shí)間更短 。

這些結(jié)構(gòu)上的差異直接導(dǎo)致了功能上的不同。盡管CAR-T細(xì)胞與TCR T細(xì)胞在顆粒酶和穿孔素的釋放總量上相當(dāng)，但CAR-T細(xì)胞的釋放動(dòng)力學(xué)更快，信號(hào)強(qiáng)度更強(qiáng) 。這種“快進(jìn)快出”的接觸模式，使得CAR-T細(xì)胞能夠在更短的時(shí)間內(nèi)完成對(duì)靶細(xì)胞的識(shí)別、殺傷和脫離，從而啟動(dòng)下一輪攻擊，為其高效的“連環(huán)殺手”行為奠定了基礎(chǔ) 。

-02-

CAR-T的核心殺傷機(jī)制

CAR-T細(xì)胞主要通過(guò)三個(gè)相互關(guān)聯(lián)的軸來(lái)介導(dǎo)其強(qiáng)大的抗腫瘤效應(yīng)，這三個(gè)軸共同構(gòu)成了一個(gè)立體、多層次的攻擊網(wǎng)絡(luò)。

1. 穿孔素與顆粒酶

這是CAR-T細(xì)胞介導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡最主要、最快速的途徑。當(dāng)CAR-T細(xì)胞與靶細(xì)胞形成免疫突觸后，其胞內(nèi)的溶酶體顆粒會(huì)極化并遷移至突觸界面，通過(guò)胞吐作用將內(nèi)容物釋放到突觸間隙 。穿孔素在靶細(xì)胞膜上“打孔”，形成通道，隨后顆粒酶通過(guò)這些通道進(jìn)入靶細(xì)胞胞質(zhì) 。一旦進(jìn)入胞質(zhì)，顆粒酶通過(guò)激活caspase依賴(lài)或非依賴(lài)性途徑，切割關(guān)鍵底物，最終誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡 。

在人類(lèi)系統(tǒng)中，無(wú)論是CD4+還是CD8+的CAR-T細(xì)胞，都主要依賴(lài)這一途徑來(lái)發(fā)揮細(xì)胞毒性作用 。實(shí)驗(yàn)證明，使用鈣離子螯合劑EGTA阻斷穿孔素的釋放，能夠基本消除CAR-T細(xì)胞介導(dǎo)的大部分殺傷活性，凸顯了該軸的核心地位 。值得注意的是，CD4+ CAR-T細(xì)胞由于胞內(nèi)穿孔素和顆粒酶的含量低于CD8+ CAR-T細(xì)胞，其殺傷效率通常較低或需要更長(zhǎng)的結(jié)合時(shí)間 。

2. Fas與Fas配體軸

Fas/FasL軸是CAR-T細(xì)胞發(fā)揮殺傷作用的另一重要途徑，尤其在處理腫瘤異質(zhì)性方面扮演著關(guān)鍵角色。該軸通過(guò)鈣非依賴(lài)性方式介導(dǎo)靶細(xì)胞裂解 。

其機(jī)制是，CAR-T細(xì)胞在識(shí)別并結(jié)合抗原陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞后被激活，從而上調(diào)其表面的FasL（Fas配體）的表達(dá) 。FasL與靶細(xì)胞表面的Fas受體結(jié)合，導(dǎo)致其三聚化，進(jìn)而激活caspase 8，最終啟動(dòng)caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡 。

這一機(jī)制最引人注目的特性是能夠介導(dǎo)“旁觀(guān)者殺傷”。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)CAR-T細(xì)胞處于一個(gè)同時(shí)包含抗原陽(yáng)性和抗原陰性腫瘤細(xì)胞的微環(huán)境中時(shí)，它們被抗原陽(yáng)性細(xì)胞激活后，能夠通過(guò)Fas/FasL軸殺傷鄰近的抗原陰性腫瘤細(xì)胞 。這種抗原非依賴(lài)性、細(xì)胞接觸依賴(lài)性的殺傷方式，為克服因抗原丟失導(dǎo)致的腫瘤復(fù)發(fā)提供了重要的機(jī)制性解決方案 。此外，在穿孔素/顆粒酶途徑受阻的情況下，F(xiàn)asL介導(dǎo)的殺傷作用可以作為補(bǔ)充，確保CAR-T細(xì)胞能夠維持其抗腫瘤活性 。

3. 細(xì)胞因子分泌

除了直接殺傷腫瘤細(xì)胞，CAR-T細(xì)胞還能通過(guò)分泌細(xì)胞因子來(lái)間接增強(qiáng)抗腫瘤效應(yīng)，這一機(jī)制在實(shí)體瘤治療中尤為重要 。

CAR-T細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，如干擾素-γ（IFN-γ），能夠作用于腫瘤基質(zhì)，上調(diào)其上的IFN-γ受體表達(dá)，并驅(qū)動(dòng)免疫細(xì)胞的重教育，例如將巨噬細(xì)胞極化為具有抗腫瘤活性的M1表型 。這種對(duì)腫瘤基質(zhì)的“致敏”作用，打破了腫瘤微環(huán)境的免疫抑制狀態(tài)，為CAR-T細(xì)胞及其他免疫細(xì)胞的功能發(fā)揮創(chuàng)造了有利條件。

更進(jìn)一步，一些被稱(chēng)為“TRUCKs”（T cells redirected for universal cytokine killing）的第四代CAR-T細(xì)胞被設(shè)計(jì)成能夠可控地在腫瘤局部釋放細(xì)胞因子（如IL-12）的“細(xì)胞工廠(chǎng)” 。這種策略實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞因子的位點(diǎn)特異性遞送，避免了全身給藥帶來(lái)的毒副作用，同時(shí)通過(guò)招募和激活先天免疫細(xì)胞、重編程基質(zhì)相關(guān)免疫抑制細(xì)胞等多重機(jī)制，極大地增強(qiáng)了抗腫瘤免疫力 。

-03-

CAR-T的動(dòng)力學(xué)特性

理想的過(guò)繼性T細(xì)胞療法應(yīng)能以相對(duì)較低數(shù)量的效應(yīng)細(xì)胞快速清除腫瘤，從而更好地控制副作用。CAR-T細(xì)胞已被證實(shí)具備這種“連環(huán)殺手”的潛力。

活細(xì)胞顯微鏡技術(shù)等先進(jìn)研究手段揭示，CAR-T細(xì)胞與TCR T細(xì)胞在連續(xù)殺傷多個(gè)靶細(xì)胞的頻率上是相當(dāng)?shù)?。盡管CAR-T細(xì)胞與單個(gè)靶細(xì)胞的結(jié)合時(shí)間更短，但其更強(qiáng)的信號(hào)強(qiáng)度和更快的殺傷動(dòng)力學(xué)，使其能夠在相同時(shí)間內(nèi)完成同等數(shù)量的殺傷循環(huán) 。

此外，CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品的組成，特別是CD4+與CD8+ T細(xì)胞的比例，對(duì)其整體功能至關(guān)重要。CD4+ T輔助細(xì)胞的缺失會(huì)導(dǎo)致CD8+ T細(xì)胞的功能障礙和凋亡 。研究表明，CD4+ CAR-T細(xì)胞雖然殺傷動(dòng)力學(xué)較慢，但它們不易發(fā)生激活誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡（AICD），并且能夠通過(guò)多重殺傷（同時(shí)與兩個(gè)或多個(gè)靶細(xì)胞結(jié)合）和連續(xù)殺傷兩種模式來(lái)貢獻(xiàn)抗腫瘤活性。因此，優(yōu)化CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品中不同亞群的比例，是提升其整體療效的關(guān)鍵研究方向之一。

-04-

優(yōu)化CAR-T細(xì)胞殺傷效能的設(shè)計(jì)策略

為了最大化CAR-T細(xì)胞的殺傷潛力并克服臨床挑戰(zhàn)，研究人員在CAR分子設(shè)計(jì)上進(jìn)行了多種優(yōu)化。

1. 親和力調(diào)節(jié)

scFv的親和力是決定CAR-T細(xì)胞活性的關(guān)鍵因素。然而，并非親和力越高越好。過(guò)高的親和力可能導(dǎo)致CAR-T細(xì)胞無(wú)法有效區(qū)分靶抗原高表達(dá)和低表達(dá)的細(xì)胞，從而增加“在靶脫瘤”毒性風(fēng)險(xiǎn) 。通過(guò)降低scFv的親和力，可以顯著增加CAR-T細(xì)胞的治療窗口，在保持強(qiáng)大抗腫瘤活性的同時(shí)，顯著降低對(duì)正常組織的攻擊 。

2. 共刺激信號(hào)域的選擇

共刺激信號(hào)域的選擇深刻影響CAR-T細(xì)胞的命運(yùn)和功能。第二代CAR-T細(xì)胞通常整合CD28或4-1BB等共刺激信號(hào)域。研究表明，整合CD28信號(hào)域的CAR-T細(xì)胞表現(xiàn)出更強(qiáng)的信號(hào)強(qiáng)度和更快的動(dòng)力學(xué)，傾向于分化為效應(yīng)T細(xì)胞表型；而整合4-1BB信號(hào)域的CAR-T細(xì)胞則更傾向于表達(dá)記憶相關(guān)基因，并在體內(nèi)表現(xiàn)出更持久的抗腫瘤活性 。第三代CAR-T細(xì)胞結(jié)合了兩種共刺激信號(hào)域，雖然增強(qiáng)了細(xì)胞毒性和細(xì)胞因子產(chǎn)生，但也可能因FasL表達(dá)上調(diào)而更容易發(fā)生AICD 。

3. 基因編輯技術(shù)的應(yīng)用

CRISPR等基因編輯技術(shù)為優(yōu)化CAR-T細(xì)胞功能提供了強(qiáng)大工具。通過(guò)基因編輯，可以同時(shí)實(shí)現(xiàn)多個(gè)目標(biāo)，例如：敲除內(nèi)源性TCR和HLA分子以開(kāi)發(fā)“通用型”CAR-T細(xì)胞；敲除PD-1、LAG-3等免疫檢查點(diǎn)分子以解除免疫抑制；敲除Fas基因以降低AICD，抵抗凋亡 。這些多基因編輯策略有望顯著增強(qiáng)CAR-T細(xì)胞的殺傷持久性和有效性。

-05-

結(jié)語(yǔ)

CAR-T細(xì)胞的殺傷機(jī)制是一個(gè)高度復(fù)雜且精密的生物學(xué)過(guò)程，它超越了傳統(tǒng)的單一模式，通過(guò)形成非經(jīng)典免疫突觸，并協(xié)同運(yùn)用穿孔素/顆粒酶、Fas/FasL和細(xì)胞因子分泌三大殺傷軸，實(shí)現(xiàn)了對(duì)腫瘤細(xì)胞快速、精準(zhǔn)且多維度的立體攻擊。其作為“連環(huán)殺手”的動(dòng)力學(xué)特性，以及通過(guò)親和力調(diào)諧、共刺激域選擇和基因編輯等策略進(jìn)行的優(yōu)化，共同構(gòu)成了CAR-T細(xì)胞強(qiáng)大抗腫瘤活性的基礎(chǔ)。隨著對(duì)這些機(jī)制理解的不斷深入和技術(shù)的持續(xù)進(jìn)步，CAR-T細(xì)胞療法必將在未來(lái)的腫瘤治療中扮演更加核心的角色。

參考文獻(xiàn)：Killing Mechanisms of Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells. Int J Mol Sci. 2019 Mar 14;20(6):1283.

       原文標(biāo)題 : CAR-T細(xì)胞的殺傷機(jī)制